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CRISPR Indel 移码突变

单 gRNA 切割后由 NHEJ 修复引入小片段插入缺失，造成编码区移码突变从而破坏基因功能。

🔬 技术详情

原理 · 流程 · 优势 · 适用

✂️ CRISPR Indel 移码突变
技术原理

利用 CRISPR/Cas9 系统设计单个 gRNA 靶向目标基因外显子区域，Cas9 蛋白在靶位点产生双链断裂。细胞通过非同源末端连接（NHEJ）修复途径，在断裂处引入少量碱基的插入或缺失（Indel），造成编码区移码突变，从而破坏目标基因的蛋白产物与功能。

工作流程
gRNA 设计 → 胚胎注射 → F0 杂交 → 移码筛选
核心优势
  • 适用性广泛，几乎所有基因均可设计
  • 小范围编辑，对邻近基因影响小
  • 敲除效率较高，针对难敲除区域有更好效果
  • 无需 donor 质粒，周期短成本低
典型适用
单基因失活 功能破坏 难敲除区 编码区移码
🧬 技术原理示意图

CRISPR/Cas9 切割与 NHEJ 修复引入 Indel

单 gRNA 靶向编码区，Cas9 双链断裂后由 NHEJ 修复引入小片段插入缺失

NHEJ-mediated Indel
genome of WT (target exon) gRNA target Cas9 + gRNA RNP Cas9 gRNA Double-strand break ↓ NHEJ repair (error-prone) ↓ genome of Indel mutant Δ few bp
Cas9 核酸酶 gRNA 引导序列 插入缺失位点 基因组 DNA
📋 详细实验流程

CRISPR Indel 移码突变标准流程

从 gRNA 设计到稳定品系构建，5 阶段共需 6-10 周

CRISPR Indel 移码突变 (※ 行业参考流程，待复核)
实验步骤 内容 周期(周)
gRNA 设计合成
  1. 靶位点筛选：外显子区域高活性 gRNA + 脱靶评估
  2. gRNA 体外转录 + Cas9 蛋白纯度验证
  3. RNP 复合物组装 + 体外切割活性检测
 1~2
显微注射
  1. 注射品系：w1118（或客户指定品系）
  2. 注射样品：Cas9 蛋白 + gRNA RNP 复合物
  3. 注射胚胎数量：400-600 个
 1
杂交和筛选
  1. F0 果蝇单只与平衡子（Balancer）杂交
  2. F1 后代通过红眼筛选标记去除
  3. 单只 F1 建系，筛选移码突变杂合个体
 2~3
分子鉴定
  1. 靶位点 PCR 扩增
  2. Sanger 测序比对确认 indel 类型
  3. 筛选移码突变纯合或杂合个体
 1~2
构建稳定品系
  1. 移码杂合子与双染色体平衡子杂交
  2. 建立稳定平衡品系或纯合品系
  3. 可选：获取多个独立移码突变以减少新蛋白干扰
 1~2
合计 — 6~10