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attP-PhiC31 定点插入

PhiC31 整合酶介导的位点特异性重组，将外源基因精准插入预设 attP 位点，避免位置效应，结果可重复性更高。

🔬 技术详情

原理 · 流程 · 优势 · 适用

🎯 PhiC31 定点插入
技术原理

PhiC31 整合酶介导 attB / attP 位点特异性重组，将外源基因精准插入果蝇基因组中预先引入的 attP 接受位点（如 ZH-attP-86Fb、VK00033 等）。由于插入位点固定，避免了随机插入造成的位置效应，不同实验批次间结果一致。

工作流程
attP 株选择 → attB 载体构建 → 整合酶注射 → 位点验证
核心优势
  • 位点专一可控
  • 避免位置效应
  • 便于跨品系比较
  • 结果可重复性高
典型适用
表达定量 跨品系比较 拯救实验 报告系统
🧬 技术原理示意图

PhiC31 整合酶介导的 attP-attB 位点特异性重组

attB / attP 位点特异性重组，将目的基因精准插入预设接受位点

attP-PhiC31 integration PhiC31
genome of attP attP donor plasmid attB insertion mini-White backbone PhiC31 ↓ Integration ↓ genome of Transgene attL insertion mini-White backbone attR
attP（基因组接受位点） attB / attL / attR（重组位点） insertion（目的基因） mini-White（筛选 marker） backbone（质粒骨架）
📋 详细实验流程

PhiC31 定点插入标准流程

从 attB 载体构建到稳定品系交付，6 阶段共需 13-22 周

attP-PhiC31 定点插入 （※ 行业参考流程，待复核）
实验步骤 内容 周期(周)
attB 供体载体构建
  1. attB 序列插入供体载体（含目的基因 + 筛选 marker，如 mini-white）
  2. 无缝克隆或多片段 Gibson 组装
  3. 供体质粒去内毒素提取与浓度校正
 1~3
显微注射
  1. 注射品系：含 attP 接受位点的胚胎（w1118 背景，如 ZH-attP-86Fb 等）
  2. 注射样品：attB 供体质粒 + PhiC31 整合酶 helper 质粒 / mRNA
  3. 注射胚胎数量：500-800 个
 2
杂交和筛选
  1. P0 果蝇与配套平衡子杂交（如 CyO / TM3 / TM6B 等）
  2. 筛选 F1 阳性果蝇（红眼或对应 marker 表达）
  3. 单只建系与表型确认
 2~3
分子鉴定
  1. attP / attB 位点 PCR 鉴定
  2. 插入位点侧翼序列测定
  3. 染色体定位与单拷贝确认
 1~2
构建稳定品系
  1. F1 阳性果蝇杂交双染色体平衡子，确定插入染色体
  2. 构建稳定/纯合品系
  3. 多代传代与遗传稳定性验证
 6~10
合计 — 13~22