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Western Blot 蛋白印迹分析

蛋白提取 · BCA 定量 · SDS-PAGE · 转膜 · 一抗二抗孵育 · 化学发光显影 · 蛋白层面验证

🔬 技术详情

原理 · 流程 · 优势 · 适用

🔬 Western Blot 蛋白印迹
技术原理

从生物样品中提取总蛋白并用 BCA 法测定浓度，等量蛋白经 SDS-PAGE 按分子量分离后通过电转移至 PVDF / NC 膜上，经脱脂奶或 BSA 封闭非特异性位点，依次孵育目标蛋白特异性一抗与酶标二抗（HRP），最后通过 ECL 化学发光或显色底物在成像系统中获得目的条带。以内参蛋白（如 GAPDH、β-actin、Tubulin）作为上样量对照。

工作流程
蛋白提取 → BCA 定量 → SDS-PAGE → 转膜 → 抗体孵育 → 显影成像
核心优势
  • 从蛋白层面验证基因表达
  • 可半定量（结合内参灰度分析）
  • 检测翻译后修饰（磷酸化 / 糖基化 / 乙酰化等）
  • 抗体特异性高，结果可信
典型适用
蛋白表达检测 磷酸化 / 修饰分析 蛋白互作（Co-IP 后） 抗体特异性验证 转基因株系验证 信号通路分析
🧬 技术原理示意图

Western Blot 三步流程示意

SDS-PAGE 分离蛋白 → 转印至膜 → 抗体特异性识别 → 显色成像

Western Blot workflow Protein Detection
SDS- PAGE 凝胶 L S1 S2 S3 → 电转 PVDF 膜 PVDF 膜 内参 ↓ → 抗体 化学 发光 显影 ↑ 目标蛋白 抗体 识别 一抗（Anti-X） + 目标蛋白 X → Ab-X + HRP-二抗 特异性识别 → 化学发光底物 → 信号成像 ↓ ECL ↓ 结果 解读 ✓ 目标条带位置 = 分子量匹配（与 marker 对照） ✓ 条带深浅 = 蛋白相对表达量（结合 ImageJ 灰度分析） ✓ 内参条带均一 = 上样量一致（数据可信前提）
蛋白 marker（分子量标准） 目标蛋白 内参（GAPDH / β-actin） 一抗（特异性识别） 化学发光显影底物
📋 详细实验流程

Western Blot 标准流程

从蛋白提取到显影成像，8 阶段共需 2-3 周

Western Blot 蛋白印迹 ※ 行业参考流程，待复核
实验步骤 内容 周期(周)
蛋白提取
  1. 样品裂解（RIPA / SDS 裂解液 + 蛋白酶抑制剂 cocktail）
  2. 超声破碎或匀浆
  3. 离心取上清（4°C · 12000 rpm · 15 min）
  4. −80°C 保存备用
 0.5
BCA 蛋白定量
  1. BCA 工作液配制（A 液 + B 液 = 50:1）
  2. 标准曲线（BSA 系列稀释 0-2000 μg/mL）
  3. 样品与工作液 37°C 孵育 30 min
  4. 酶标仪读取 A562 · 计算浓度
  5. 调整上样量一致（加 loading buffer + 煮沸 5 min 变性）
 0.2
SDS-PAGE 电泳
  1. 制胶（浓缩胶 5% + 分离胶 8-12%，按目标蛋白分子量选择）
  2. 上样（每孔 20-50 μg 总蛋白，含 marker）
  3. 电泳：80 V 浓缩 → 120 V 分离（溴酚蓝到底）
 0.3
转膜
  1. PVDF 膜甲醇活化 30 s
  2. 湿转 / 半干转（300 mA · 60-90 min · 冰浴）
  3. 丽春红染色验证转膜效率（可选）
 0.2
封闭
  1. 5% 脱脂奶 / BSA（TBST 配制）
  2. 室温封闭 1-2 h（或 4°C 过夜）
 0.1
一抗孵育
  1. 按说明书稀释一抗（1:500-1:5000）
  2. 4°C 摇床孵育过夜（12-16 h）
  3. TBST 洗膜 3 × 10 min
 0.3
二抗孵育
  1. HRP 标记二抗（1:5000-1:10000）
  2. 室温孵育 1-2 h
  3. TBST 洗膜 3 × 10 min
 0.1
显影与结果分析
  1. ECL 化学发光底物（A + B 液 1:1 混合）
  2. 化学发光成像系统采集图像（自动 / 手动曝光）
  3. ImageJ 灰度分析：目标条带 / 内参条带 = 相对表达量
  4. 交付原始条带图 + 量化柱状图 + 实验报告
 0.2
合计 — 2~3