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qPCR 基因表达检测

总 RNA 提取 · 反转录 cDNA · 实时荧光定量 PCR · 输出表达量 / 差异倍数 / 统计学显著性

🔬 技术详情

原理 · 流程 · 优势 · 适用

🦠 qPCR 基因表达检测
技术原理

从生物样品中提取总 RNA 并反转录为 cDNA，加入目标基因特异性引物与荧光染料（SYBR Green）或荧光探针（TaqMan）在实时 PCR 仪上进行扩增。每经过一个循环采集荧光信号，得到 Ct 值（达到阈值所需循环数），用 ΔΔCt 法计算目标基因相对内参基因（如 GAPDH、β-actin、RP49）的表达差异。

工作流程
RNA 提取 → 反转录 → qPCR 上机 → 数据分析
核心优势
  • 高灵敏度（可检测低拷贝数转录本）
  • 高特异性（引物 / 探针双重识别）
  • 可绝对定量（标准曲线法）或相对定量（ΔΔCt 法）
  • 熔解曲线验证扩增特异性
典型适用
基因表达定量 差异表达分析 时空表达谱 通路验证 RNAi 敲降效率 转基因表达水平
🧬 技术原理示意图

实时荧光定量 PCR 原理

每循环采集荧光信号，Ct 值反映起始模板量，ΔΔCt 法计算表达差异

Real-time qPCR workflow Gene Expression
total RNA mRNA → cDNA（反转录） → qPCR 反应 扩增 曲线 ΔRn cycle threshold Ct1 Ct2 Ct3 -dF/dT Temp 单峰 = 特异 扩增曲线（Amplification） 熔解曲线（Melt Curve） ΔΔCt 分析 ΔCt = Ct(目标) − Ct(内参) ΔΔCt = ΔCt(实验) − ΔCt(对照) → Fold change = 2^−ΔΔCt 96 孔 板布局 A B C D 1 2 3 4 5 6 7 8 ● 目标基因（实验组） ● 目标基因（其他） ● 目标基因（对照） ● 内参基因 ○ NTC（无模板对照）
mRNA（总 RNA 中目标转录本） cDNA（反转录产物） 内参基因（GAPDH / β-actin / RP49） 扩增曲线（Ct 值） 熔解曲线（单峰 = 特异）
📋 详细实验流程

qPCR 基因表达检测标准流程

从 RNA 提取到结果报告，4 阶段共需 3-5 周

qPCR 基因表达定量分析
实验步骤 内容 周期(周)
总 RNA 提取
  1. 样品类型沟通（细胞 / 组织 / 果蝇个体等）与样品预处理
  2. TRIzol 法或柱式法提取总 RNA
  3. DNase I 处理去除基因组 DNA 污染
  4. RNA 浓度 / 纯度检测（Nanodrop A260/A280 比值）
  5. 琼脂糖凝胶电泳验证 28S / 18S 完整性
 0.5~1
反转录 cDNA
  1. 反转录引物选择（Oligo dT / Random hexamer / 特异性引物）
  2. MMLV 逆转录酶反应（25°C 退火 → 42°C 延伸 → 85°C 灭活）
  3. cDNA 产物质检（可选）
  4. cDNA 稀释备用（−20°C 保存）
 0.5~1
qPCR 上机定量
  1. 目标基因特异性引物设计与验证（特异性 / 扩增效率 95-105%）
  2. 反应体系配制（SYBR Green 预混液 + 引物 + cDNA）
  3. 96 孔板 / 384 孔板上机（3 技术重复 + 内参 + NTC）
  4. 扩增程序：95°C 预变性 → 40 个循环（95°C 变性 → 60°C 退火延伸）→ 熔解曲线
 1
上机分析与结果报告
  1. Ct 值采集与质量控制（重复性、熔解曲线单峰）
  2. ΔΔCt 法计算相对表达量（含内参校正）
  3. 统计学分析（t 检验 / ANOVA / 多重比较）
  4. 输出：扩增曲线图 / 熔解曲线图 / 柱状图 + 显著性标记 / 原始 Ct 值表
  5. 交付完整实验报告（含方法、结果、结论、原始数据）
 1~2
合计 — 3~5