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🧬 技术服务 · 果蝇基因编辑 · 子类

CRISPR KI (Replacement) 基因替换

通过 HR 修复将内源基因替换为外源同源基因，特别适合内源序列与替换序列相似度较低的情况。

🔬 技术详情

原理 · 流程 · 优势 · 适用

🔄 CRISPR KI (Replacement) 基因替换
技术原理

设计 gRNA 靶向目标内源基因编码区，构建含长同源臂（5' / 3' HA 各 1-2 kb）+ 外源同源基因序列（如人类、小鼠、斑马鱼等物种的同源基因）的 donor 质粒。Cas9 切割后细胞通过 HR 修复，将内源基因整段替换为外源插入序列。该方案特别适合**内源序列与替换序列相似度较低**的情况，避免同源臂识别冲突。

工作流程
长臂 donor 设计 → 胚胎注射 → 替换筛选 → 功能验证
核心优势
  • 可替换为其他物种同源基因（如人源基因在果蝇中建模）
  • 低相似度序列适用，同源臂识别无冲突
  • 保留原位染色体环境与调控元件
  • 支持引入特定突变版本
典型适用
跨物种建模 人类基因功能 同源替换 进化保守研究
🧬 技术原理示意图

CRISPR/Cas9 + HR 介导基因替换

长同源臂 donor 引导 HR 修复，将内源基因整段替换为外源同源基因序列

Gene replacement KI (Replacement)
genome of WT (endogenous gene) endogenous gene donor plasmid 5' HA foreign ortholog 3' HA marker backbone Cas9 + donor co-injection ↓ Homologous recombination (HR) ↓ genome of Replacement-KI 5' HA foreign ortholog 3' HA marker
长 5' / 3' 同源臂（HA） 外源同源基因 内源基因（被替换） 筛选 marker backbone（质粒骨架）
📋 详细实验流程

CRISPR KI (Replacement) 基因替换标准流程

从 donor 设计到稳定品系构建，6 阶段共需 10-18 周（长同源臂构建 + HR 验证）

CRISPR KI (Replacement) 基因替换 (※ 行业参考流程，待复核)
实验步骤 内容 周期(周)
长臂 donor 构建
  1. 选择外源同源基因（人 / 小鼠 / 斑马鱼等物种同源序列）
  2. 构建含 5' / 3' 长同源臂（各 1-2 kb）+ 外源基因 + marker 的 donor 质粒
  3. 无缝克隆或 Gibson Assembly 拼接长片段
 2~4
gRNA 设计合成
  1. 靶位点筛选：内源基因编码区 5' / 3' 端各选 1 个 gRNA
  2. 脱靶评估 + 体外转录
 1~2
显微注射
  1. 注射品系：w1118（或客户指定品系）
  2. 注射样品：双 Cas9 RNP + 长臂 donor（高浓度）
  3. 注射胚胎数量：500-800 个
 1~2
杂交和筛选
  1. F0 单只与平衡子杂交
  2. F1 筛选 marker 阳性个体
  3. 跨 5' / 3' 连接区 PCR 验证 HR（双向确认）
 3~5
分子鉴定
  1. 5' / 3' 连接区 Sanger 测序确认精准替换
  2. 外源基因 ORF 完整性验证（RT-PCR + 测序）
  3. 全基因组拷贝数验证（排除随机插入）
 2~3
构建稳定品系
  1. HR 阳性杂合子与平衡子杂交
  2. 建立稳定平衡品系或纯合品系
  3. 外源基因表达检测（RT-qPCR / WB）
 1~2
合计 — 10~18