果蝇转基因 果蝇基因编辑 果蝇行为学分析 果蝇衰老寿命检测 果蝇衰老寿命检测 果蝇衰老寿命检测 常规寿命检测 药物筛选寿命检测 抗氧化应激寿命实验 毒力测定实验 其他指标检测 果蝇品系供应 果蝇建系与扩增 果蝇实验教学平台搭建 昆虫基因编辑 分子生化实验
🧬 技术服务 · 果蝇基因编辑 · 子类

CRISPR KI (Tag) 标签插入

通过 CRISPR 与 donor 共同作用，HR 修复在 N 端或 C 端精准插入 Tag 标签，分析目标基因的表达模式。

🔬 技术详情

原理 · 流程 · 优势 · 适用

🏷️ CRISPR KI (Tag) 标签插入
技术原理

设计 gRNA 靶向目标基因终止密码子附近或起始密码子附近，同时构建含有同源臂（HAs）+ Tag 序列（GFP、FLAG、HA、Myc、V5 等）的 donor 质粒。Cas9 切割后细胞通过同源重组（HR）修复，将 Tag 精准插入内源基因的 N 端或 C 端。提供**有筛选标记（marker）**与**无筛选标记**两种方案。

工作流程
donor 设计 → 胚胎注射 → HR 筛选 → 纯合建系
核心优势
  • 精准 N 端 / C 端插入，不破坏内源调控
  • 有 / 无 marker 双方案，灵活适配下游应用
  • 可分析基因表达模式与蛋白亚细胞定位
  • 支持多种常用 Tag（GFP / FLAG / HA / Myc / V5 等）
典型适用
蛋白定位 表达追踪 纯化标签 报告基因
🧬 技术原理示意图

CRISPR/Cas9 + HR 介导 Tag 标签插入

Cas9 在靶位点切割后，donor 上的同源臂引导 HR 修复，将 Tag 序列精准插入 N 端或 C 端

Homologous recombination KI (Tag)
genome of WT (target gene) Cas9 cut site donor plasmid 5' HA Tag (GFP) 3' HA marker (optional) backbone Cas9 + donor co-injection ↓ Homologous recombination (HR) ↓ genome of Tag-KI 5' HA Tag (GFP) 3' HA marker
5' / 3' 同源臂（HA） Tag 标签序列 筛选 marker（可选） backbone（质粒骨架）
📋 详细实验流程

CRISPR KI (Tag) 标签插入标准流程

从 donor 设计到稳定品系构建，6 阶段共需 10-16 周（HR 效率较低，周期较长）

CRISPR KI (Tag) 标签插入 (※ 行业参考流程，待复核)
实验步骤 内容 周期(周)
donor 设计合成
  1. 选择 Tag 类型：GFP / FLAG / HA / Myc / V5 等
  2. 构建含 5' / 3' 同源臂（各 500-1000 bp）+ Tag 序列的 donor 质粒
  3. 可选：加入筛选 marker（mini-White 等）
 2~3
gRNA 设计合成
  1. 靶位点筛选：N 端或 C 端起始 / 终止密码子附近
  2. gRNA 体外转录 + Cas9 RNP 组装
 1~2
显微注射
  1. 注射品系：w1118（或客户指定品系）
  2. 注射样品：Cas9 RNP + donor 质粒（高浓度）
  3. 注射胚胎数量：500-800 个（提高 HR 命中率）
 1~2
杂交和筛选
  1. F0 果蝇单只与平衡子杂交
  2. F1 筛选 marker 阳性个体
  3. 跨连接区 PCR 筛选 HR 阳性个体（排除随机插入）
 3~4
分子鉴定
  1. 5' / 3' 连接区 Sanger 测序确认精准插入
  2. 全基因组拷贝数验证（排除随机插入）
  3. Western blot / 免疫荧光验证 Tag 表达
 2~3
构建稳定品系
  1. HR 阳性杂合子与平衡子杂交
  2. 建立稳定平衡品系或纯合品系
  3. 无 marker 方案可通过 Cre / Flp 重组去除
 1~2
合计 — 10~16