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🧪 技术服务 · 分子生化 · 子类

载体构建 服务

质粒亚克隆 · 基因组 DNA 克隆 · 反转录 cDNA 克隆 · 覆盖 4 类应用载体的全场景构建

🔬 技术详情

原理 · 流程 · 优势 · 适用

🧪 载体构建
技术原理

通过限制性酶切或无缝克隆将目的片段连接到目标载体骨架中，转化感受态细胞后经抗性筛选与菌落 PCR 鉴定获得阳性克隆，最终通过 Sanger 测序验证插入序列的准确性。按片段来源可分为三类：质粒亚克隆（从已有质粒切取）、基因组 DNA 克隆（直接从生物体基因组扩增）、反转录 cDNA 克隆（从 mRNA 反转录获得）。

工作流程
载体设计 → 片段获取 → 酶切连接 → 转化筛选 → 测序验证
核心优势
  • 三种克隆方式灵活组合
  • 4 类应用载体可选（昆虫 / 大肠杆菌 / 哺乳动物 / 多功能）
  • 无缝克隆 / 限制性酶切双方案
  • 全 Sanger 测序验证保证序列准确性
典型适用
过表达载体 CRISPR 编辑载体 原核表达 哺乳动物细胞表达 报告基因 荧光标记 双杂交系统
🧬 技术原理示意图

重组质粒的典型结构

骨架 + 启动子 + MCS + 插入片段 + 筛选 marker 是重组质粒的核心元件

Recombinant plasmid map Vector Construction
recombinant plasmid Promoter MCS Insertion 3'UTR Selection backbone (ori + AmpR + ...) 三种片段来源 质粒亚克隆 基因组 DNA 克隆 反转录 cDNA 克隆 从已有质粒切取特定片段 从基因组 DNA 扩增目标基因 从 mRNA 反转录获得
Promoter（启动子） MCS（多克隆位点） Insertion（插入片段） 3'UTR（非翻译区） Selection（筛选 marker） backbone（质粒骨架 · 含 ori + 抗性）
📋 详细实验流程

载体构建标准流程

从载体设计到测序验证，5 阶段共需 3-4 周

载体构建（含 3 种克隆方式）
实验步骤 内容 周期(周)
载体设计与引物合成
  1. 沟通实验需求与目标载体类型（昆虫 / 大肠杆菌 / 哺乳动物 / 多功能）
  2. 设计克隆方案（无缝克隆 / 限制性酶切）
  3. 设计特异性引物（含酶切位点或同源臂）
  4. 引物合成（送公司，2-3 工作日）
 0.5~1
片段获取
  1. 质粒亚克隆：从已有质粒酶切回收目标片段
  2. 基因组 DNA 克隆：从样品提取基因组 DNA → PCR 扩增
  3. 反转录 cDNA 克隆：提取总 RNA → 反转录 → PCR 扩增
  4. PCR 产物回收纯化
 1~1.5
酶切连接
  1. 载体骨架线性化（限制性酶切或反向 PCR）
  2. 插入片段与载体连接（T4 连接酶或无缝克隆试剂盒）
 0.5
转化与筛选
  1. 转化 DH5α 感受态细胞
  2. 抗性平板（Kan / Amp 等）筛选
  3. 挑取单克隆 → 菌落 PCR 鉴定
  4. 阳性克隆扩培 + 质粒小提
 0.5
测序验证
  1. Sanger 测序（送公司，2-3 工作日）
  2. 序列比对与确认（无突变 / 插入方向正确 / 读码框正确）
  3. 交付测序报告 + 甘油菌 / 质粒 DNA
 1
合计 — 3~4