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🧬 技术服务 · 果蝇基因编辑 · 子类

CRISPR Point Mutation 点突变

通过同义突变 donor 在目标氨基酸两侧引入标记，HR 修复精准实现氨基酸位点替换。

🔬 技术详情

原理 · 流程 · 优势 · 适用

🎯 CRISPR Point Mutation 点突变
技术原理

设计 gRNA 靶向目标氨基酸编码位点附近，构建含同源臂 + 点突变序列（Point Mutation, PM）的 donor 质粒。在目标氨基酸编码位点**两侧引入若干同义突变**（不改变氨基酸但改变密码子），既可防止 Cas9 持续切割已修复位点，又便于分子鉴定筛选。Cas9 切割后细胞通过 HR 修复，实现基因组 DNA 序列精准替换，造成目的氨基酸点突变。

工作流程
同义突变 donor → 胚胎注射 → 点突变筛选 → 纯合建系
核心优势
  • 同义突变提升编辑与分子鉴定效率
  • 不影响基因表达与蛋白功能
  • 免费提供黑腹果蝇同源基因及对应位点分析
  • 可跨物种表型验证（同源位点替换模型）
典型适用
疾病位点建模 关键氨基酸 功能域突变 保守位点研究
🧬 技术原理示意图

CRISPR/Cas9 + HR 介导点突变

donor 在目标氨基酸两侧引入同义突变，提升编辑与分子鉴定效率

Amino acid substitution Point Mutation
genome of WT (target codon) WT target AA donor plasmid (with synonymous mutations) 5' HA synonymous mutation PM synonymous mutation 3' HA backbone Cas9 + donor co-injection ↓ HR + synonymous-mediated screening ↓ genome of Point Mutant syn. PM syn.
5' / 3' 同源臂（HA） 点突变密码子（PM） 同义突变（提升筛选效率） 原目标氨基酸（被替换） backbone（质粒骨架）
📋 详细实验流程

CRISPR Point Mutation 点突变标准流程

从 donor 设计到稳定品系构建，6 阶段共需 9-15 周（含同义突变优化设计）

CRISPR Point Mutation 点突变 (※ 行业参考流程，待复核)
实验步骤 内容 周期(周)
位点分析与 donor 设计
  1. 目标氨基酸位点分析 + 同义突变位点设计（目标 AA 两侧各 1-3 个）
  2. 构建含 5' / 3' HA（各 500-800 bp）+ 点突变密码子 + 同义突变标记的 donor 质粒
  3. 免费提供黑腹果蝇同源基因及对应位点分析服务
 2~3
gRNA 设计合成
  1. 靶位点筛选：尽量靠近目标氨基酸编码位点
  2. 切割位点落在同义突变区间内（防止再次切割）
  3. gRNA 体外转录 + Cas9 RNP 组装
 1~2
显微注射
  1. 注射品系：w1118（或客户指定品系）
  2. 注射样品：Cas9 RNP + 点突变 donor 质粒
  3. 注射胚胎数量：500-700 个
 1
杂交和筛选
  1. F0 单只与平衡子杂交
  2. F1 筛选 marker 阳性个体
  3. 利用同义突变引入的限制性酶切位点或错配 PCR 初步筛选
 2~4
分子鉴定
  1. 靶区 PCR + Sanger 测序确认点突变精准替换
  2. 同义突变存在性验证（证明 HR 而非 NHEJ）
  3. 邻近氨基酸序列验证（无意外突变）
 2~3
构建稳定品系
  1. 点突变杂合子与平衡子杂交
  2. 建立稳定平衡品系或纯合品系
  3. 可选：表型验证（与人类疾病位点对应表型比对）
 1~2
合计 — 9~15