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🧬 技术服务 · 果蝇基因编辑 · 子类

CRISPR KO 大片段敲除

双 gRNA 切割两个靶点，NHEJ 修复连接后删除中间整段序列，已验证 100kb+ 大片段敲除经验。

🔬 技术详情

原理 · 流程 · 优势 · 适用

🚫 CRISPR KO 大片段敲除
技术原理

在基因组中两个相距一定距离（kb 到 Mb 级）的靶点同时设计 gRNA，Cas9 蛋白在两个位点分别产生双链断裂。细胞通过 NHEJ 修复将两个断裂末端连接，中间整段序列随之丢失。该方案可一次性删除目标基因的核心功能域、整个编码区甚至整段基因簇。

工作流程
双 gRNA 设计 → 胚胎注射 → 缺失筛选 → 稳定建系
核心优势
  • 可敲除 100kb 以上基因组大片段
  • 优化设计方案，最小化对邻近基因影响
  • 特异性高，避免单点编辑的潜在漏检
  • 适合基因簇或整段调控区域删除
典型适用
大片段缺失 基因簇敲除 功能域删除 调控区删除
🧬 技术原理示意图

双 gRNA 切割 + NHEJ 删除大片段

两个 gRNA 同时靶向相距一定距离的两个位点，NHEJ 修复后丢失中间整段序列

Large deletion CRISPR KO
genome of WT gRNA-1 gRNA-2 2x Cas9 + 2 gRNAs Cas9 Cas9 Two double-strand breaks ↓ NHEJ ligation · large deletion ↓ genome of KO mutant Δ large fragment (kb ~ Mb)
Cas9 核酸酶（双） gRNA × 2 引导序列 大片段删除区 基因组 DNA
📋 详细实验流程

CRISPR KO 大片段敲除标准流程

从双 gRNA 设计到稳定品系构建，6 阶段共需 7-12 周

CRISPR KO 大片段敲除 (※ 行业参考流程，待复核)
实验步骤 内容 周期(周)
双 gRNA 设计合成
  1. 靶位点筛选：在目标基因上下游选择两个合适切割位点（间距 kb ~ Mb）
  2. 脱靶评估 + 双 gRNA 体外转录
  3. Cas9 RNP 复合物组装 + 体外活性检测
 1~2
显微注射
  1. 注射品系：w1118（或客户指定品系）
  2. 注射样品：双 Cas9 RNP（gRNA-1 + gRNA-2）
  3. 注射胚胎数量：500-700 个（提高双切效率）
 1
杂交和筛选
  1. F0 果蝇单只与平衡子杂交
  2. F1 后代筛选标记去除
  3. 跨靶点 PCR 初步筛选大片段缺失个体
 2~3
分子鉴定
  1. 跨缺失区 PCR 扩增确认片段大小
  2. 缺失区两端 Sanger 测序确定断点
  3. 必要时 qPCR 验证拷贝数变异
 1~2
表型初筛
  1. 纯合 / 杂合敲除个体活力与生育力评估
  2. 必要时 RT-qPCR 检测邻近基因表达是否受影响
 1~2
构建稳定品系
  1. 缺失杂合子与双染色体平衡子杂交
  2. 建立稳定平衡品系或纯合品系
 1~2
合计 — 7~12